本研究系统比较了错配修复缺陷（dMMR）子宫内膜癌（ECs）中，基于PCR的微卫星不稳定性检测（PCR-MSI）所发现的微卫星偏移模式，并分析了微卫星微小偏移与显著偏移相关的临床病理特征。通过免疫组化（IHC）筛选出285例dMMR ECs，采用美国国家癌症研究所（NCI）推荐的5个位点评估微卫星偏移模式。微卫星微小偏移定义为至少1个位点出现1-3个核苷酸重复偏移。随后分析微卫星微小偏移组与显著偏移组的临床病理特征；最后通过MLH1启动子甲基化检测和MMR基因胚系突变检测，对MMR-IHC与PCR-MSI结果不一致的病例进行进一步分析。
285例dMMR ECs经IHC检测显示：169例（59.3%）为MLH1与PMS2联合缺失，54例（18.9%）为MSH2与MSH6联合缺失，39例（13.7%）为MSH6单独缺失，23例（8.1%）为PMS2单独缺失。MMR-IHC与PCR-MSI的不一致率为12.3%（35/285）。采用微卫星微小偏移标准重新评估后，13例微卫星不稳定性低（MSI-L）病例因存在微卫星微小偏移被重新判定为微卫星不稳定性高（MSI-H），MMR-IHC与MSI-PCR的不一致率降至7.7%（22/285）。此外，结果不一致病例中，91%（20/22例）出现单核苷酸位点的微卫星微小偏移。7例MLH1/PMS2缺陷病例中，3例成功检测出MLH1启动子甲基化。22例不一致病例中13例成功完成MMR基因胚系检测，11例存在MSH6胚系突变，3例携带移码缺失突变（p.F1088Lfs*）。总体而言，微卫星微小偏移发生率分别为：MSH6单独缺失组100%（39/39）、MLH1与PMS2联合缺失组85.8%（145/169）、MSH2与MSH6联合缺失组66.7%（36/54）、PMS2单独缺失组47.9%（11/23）。微卫星微小偏移组与显著偏移组的临床病理特征无相关性。
dMMR ECs存在高频率的微卫星微小偏移，尤其在MSH6单独缺失病例中更为显著。MMR-IHC与MSI-PCR联合检测可提高MSI检测准确性，助力ECs精准治疗策略制定。
研究背景
微卫星不稳定性（MSI）指基因组中广泛存在的短串联重复序列（即微卫星，MS）长度发生改变。DNA复制过程中重复单元的插入或缺失，以及错配修复（MMR）系统缺陷，会导致微卫星等位基因长度改变，形成MSI相关分子表型。这种复制错误表型被认为是遗传性肿瘤易感综合征的标志，该综合征会增加患者患多种肿瘤的风险，尤以结直肠癌和子宫内膜癌（EC）最为常见。林奇综合征（LS）又称遗传性非息肉病性结直肠癌综合征，是由MMR基因（包括MLH1、PMS2、MSH2、MSH6或EPCAM）致病性胚系变异引起的常染色体显性遗传病。EC是林奇综合征女性患者最常见的肠外肿瘤，也是林奇综合征的哨兵肿瘤，患者终生患病风险约40%-60%。EC中MMR免疫组化（IHC）染色和MSI检测最初用于林奇综合征筛查，3%-5%的EC病例可确诊林奇综合征，这也是EC最常见的遗传性肿瘤综合征。无论采用何种筛查策略，均需进行MLH1启动子甲基化分流检测，以识别林奇综合征高风险患者，同时也能解释EC中绝大多数dMMR或MSI病例的成因。
MSI-H型EC是EC四种公认分子亚型之一，预后相对较好。因此，MMR或MSI检测对EC分子分型、预后评估、林奇综合征筛查及免疫治疗疗效预测至关重要。美国病理学家协会（CAP）现行指南推荐对所有EC病例行dMMR/MSI检测。尽管这两种检测方法相关性较强，但临床实践中仍存在结果不一致的情况。与结直肠癌（CRC）相比，EC中微卫星微小偏移（受累位点出现1-3个核苷酸重复偏移）的发生率显著更高。本研究旨在比较EC中MLH1、PMS2、MSH2、MSH6不同缺陷类型对应的微卫星偏移模式，分析微卫星偏移模式比例与临床病理特征的相关性，以及结果不一致病例的微卫星模式特征。
研究方法
所有EC病例均在与MMR-IHC检测相同的肿瘤组织块上进行PCR-MSI检测。与正常样本相比，肿瘤样本等位基因峰出现核苷酸偏移（向左或向右）。MSI状态判定标准：≥2个位点不稳定为MSI-H；仅1个位点不稳定为MSI-L；无位点不稳定为微卫星稳定（MSS）。对比每例患者肿瘤与正常样本的电泳图谱，标记2B/3D marker位点最左侧或最右侧有效峰（有效峰峰高＜最高峰5%）。记录肿瘤与配对样本最左侧或最右侧有效峰的大小差值，定义为绝对核苷酸偏移，代表肿瘤样本微卫星重复序列长度。按试剂盒定义（图2A）：当单个核苷酸位点出现≥2个核苷酸或碱基变化（双核苷酸位点≥4个）时，判断其为不稳定位点。与配对正常组织相比，≥2个位点出现MSI判定为MSI-H，仅1个位点为MSI-L，无位点为MSS。此外，本研究进一步复核微卫星微小偏移（图2B），将单核苷酸或双核苷酸位点出现≥1个核苷酸或碱基变化即重新判定为不稳定。微卫星微小偏移指受累位点出现1-3个核苷酸变异（图3C），显著偏移指≥3个核苷酸或碱基变化（图3F）。
图1
图2
图3
通过MLH1启动子甲基化检测和MMR基因胚系突变检测对MMR/MSI不一致的子宫内膜癌病例进行分析，多基因NGS panel包含MLH1、MSH2、MSH6、PMS2、EPCAM等基因，可检测目标基因的单核苷酸变异（SNVs）、插入缺失变异（InDels）及拷贝数变异（CNVs）。此外，对IHC显示MLH1缺陷的肿瘤行甲基化特异性PCR检测MLH1启动子甲基化。
研究结果
dMMRECs的临床病理特征：
2020年10月至2024年5月，四川大学华西第二医院共确诊1088例EC患者，其中285例（26.2%）为dMMR型，纳入本研究。队列中子宫内膜样癌249例（87.4%）、混合癌19例（6.7%）、未分化与去分化子宫内膜癌7例（2.5%）、癌肉瘤6例（2.1%）、透明细胞癌4例（1.4%）。患者中位年龄54岁（范围32-82岁），83.5%为早期（FIGO Ⅰ-Ⅱ期），100例（35.1%）存在脉管侵犯，34例（11.9%）发生淋巴结转移。285例dMMR患者中，169例（59.3%）MLH1与PMS2表达缺失，53例（18.9%）MSH2与MSH6表达缺失，39例（13.7%）仅MSH6表达缺失，23例（8.1%）仅PMS2表达缺失。患者详细特征见表1。
表1
dMMRECs相关的微卫星不稳定性模式：
按单核苷酸位点偏移≥2个核苷酸、双核苷酸位点偏移≥4个核苷酸的标准行PCR-MSI分析，87.7%（250/285）病例为MSI-H，4.6%（13/285）为MSI-L，7.7%（22/285）为MSS，MMR-IHC与PCR-MSI不一致率为12.3%（35/285）（图2A）。采用微小偏移标准重新评估后，13例MSI-L病例因存在微卫星微小偏移被重新归类为MSI-H，MMR-IHC与MSI-PCR一致性从87.7%提升至92.3%（图2B）。值得注意的是，MSH6单独缺失病例中MMR-IHC与PCR-MSI不一致率最高，即便纳入微小偏移判读标准，仍达38.5%。
PCR-MSI结果显示，MSH6单独缺失组5个位点的微卫星重复序列平均数量显著低于PMS2单独缺失组（P＜0.001，图4A-E）。联合缺失组中，除MLH1/PMS2联合缺失组BAT25位点平均重复数少于3个核苷酸外，其余组均超过3个。此外，MSH6单独缺失组的微卫星不稳定性位点平均数量显著低于其他组（均值±标准差：1.8±0.9，P＜0.001，图4F）。单核苷酸位点比双核苷酸位点更易发生微小偏移，各位点发生率：BAT26为50.1%、BAT25为58.5%、D5S346为12.2%、D17S250为8.4%、D2S123为7.0%。
图4
总体而言，81.1%（231/285）dMMR相关MSI型ECs存在微卫星微小偏移。具体微小偏移发生率：MLH1与PMS2联合缺失组62.8%（145/231）、MSH6单独缺失组16.9%（39/231）、MSH2与MSH6联合缺失组15.6%（36/231）、PMS2单独缺失组4.7%（11/231）。有趣的是，所有MSH6缺陷EC患者（100%，39/39）均出现微小偏移，而PMS2缺陷病例中仅不到一半（47.9%，11/23）出现该特征（图3B）。不同模式的代表性微卫星图谱见图3C、3F，MSH6单独缺失（图3A）或PMS2单独缺失（图3D）病例呈现截然不同的偏移模式。此外，近70%的PMS2单独缺失病例出现3个以上位点不稳定（图3E）。
临床病理特征与微小微卫星不稳定性的相关性：
本研究中81.1%（231/285例）dMMR ECs存在微卫星微小偏移。进一步比较微小偏移组（微小偏移/显著偏移＞50%）与大偏移组（微小偏移/显著偏移≤50%）的临床病理特征，结果显示年龄、组织学类型、分级、FIGO分期、脉管侵犯、淋巴结转移均无显著差异（P＞0.05，表1）。但两组MMR蛋白表达模式差异显著：与微小偏移组相比，大偏移组PMS2单独缺失比例更高（12% vs. 1%，P＜0.001），MSH6单独缺失比例更低（4.9% vs. 29.4%，P＜0.001）。如预期所示，大偏移组与MMR缺陷的一致性更高（微小偏移＞50%组为80.4%，≤50%组为98.9%，P＜0.001）；相反，微小偏移组的结果不一致率显著高于大偏移组（19.9% vs. 1.1%，P＜0.001）。
结果不一致病例的微卫星模式特征：
22例结果不一致病例中，8例（36.4%）有肿瘤家族史，包括结直肠癌、EC、肝癌、肺癌、乳腺癌、淋巴瘤、胃癌。其中75%为MSH6单独缺失，MLH1与PMS2联合缺失占25%（2/8例）（表2）。对MLH1缺陷病例行MLH1启动子甲基化检测，7例中3例成功检测出甲基化。22例患者中13例成功完成MMR基因胚系检测，11例存在MSH6胚系突变，3例突变位点相同（MSH6，p.F1088Lfs*）。尽管MMR蛋白异常病例中均存在一定比例的微小偏移和显著偏移，但结果不一致病例中单核苷酸位点微小偏移发生率显著更高（91%，20/22例）。仅2例为MLH1与PMS2联合缺失伴大偏移（＞3个核苷酸）（表2）。
表2
讨 论
本研究基于285例dMM RECs的回顾性分析，通过PCR毛细管电泳评估NCI推荐的微卫星不稳定性检测中微卫星微小偏移在EC中的应用价值。结果表明，dMMR ECs存在高频率微卫星微小偏移，且四种MMR蛋白表达类型对应不同的微卫星偏移模式，其中MSH6单独缺失与PMS2单独缺失相比，结果差异尤为显著。
MSI状态检测对肿瘤患者管理至关重要，可作为林奇综合征的预测标志物（不受原发肿瘤类型限制），同时预测免疫检查点抑制剂疗效，对EC分子亚型识别意义重大。现有文献虽探讨了MMR-IHC与PCR-MSI的一致性，但多数研究存在样本量小、缺乏特定肿瘤大样本基于人群分析等局限。一项分析50例MSI-H型子宫内膜癌的研究发现微卫星偏移模式，52%的MSI-H病例存在微卫星微小偏移（定义为受累位点1-3个核苷酸重复偏移）。作为中国西南地区最大的妇科肿瘤中心，本研究收集285例dMMR型EC病例，由两位分子病理医师按标准化方法重新分析微卫星偏移模式。结果证实微卫星微小偏移是普遍现象，其发生率与MMR蛋白表达模式相关。本研究中81.1%的dMMR ECs存在微卫星微小偏移，其中MLH1与PMS2联合缺失组占62.8%、MSH6单独缺失组16.9%、MSH2与MSH6联合缺失组15.6%、PMS2单独缺失组4.7%，与Wu等研究结果一致，该研究也发现MLH1与PMS2联合缺失的微小偏移发生率最高。但四种MMR缺陷类型的微卫星微小偏移比例存在显著差异，所有MSH6单独缺失病例（100%）均出现微小偏移，而PMS2单独缺失病例仅47.9%出现该特征。这提示临床诊断中忽略微小偏移可能导致微卫星不稳定性误判。
既往EC与CRC的MSI对比分析发现，两种肿瘤的缺失/插入片段大小存在差异，EC的微卫星改变更短、核苷酸偏移更小。本研究进一步发现MSI-H型EC常表现为微卫星序列微小偏移，且MSH6单独缺失与微小偏移模式相关，易被误判为MSI-L或MSS肿瘤。这些发现揭示了MSI-H型EC与CRC存在不同的致病机制，凸显检测微卫星微小偏移对准确判读的重要性。根据CAP指南，考虑接受免疫检查点抑制剂治疗的EC患者，MMR蛋白IHC检测优于PCR-MSI或NGS方法，该推荐基于IHC在多数实验室普及、成本低且与分子检测一致性高的特点。同样，美国临床肿瘤学会（ASCO）免疫治疗诊断指南推荐结直肠癌行MMR-IHC、MSI-PCR、NGS检测；其他胃肠道肿瘤（结直肠、胃、食管）行MMR-IHC和MSI-PCR检测；EC仅行MMR-IHC检测。考虑到样本类型（刮宫或子宫切除标本）、标本前处理条件（缺血时间、固定时间）、IHC染色技术（抗原修复方法、克隆选择）的差异，dMMR EC通常呈现不同比例、强度及MMR蛋白表达模式组合。尤其对于MMR蛋白表达亚克隆缺失的EC患者，减少误判或结果不确定仍存在实际挑战。因此，MMR-IHC与MSI-PCR联合应用是识别dMMR肿瘤最敏感、特异的方法。
既往研究表明，出现微卫星微小偏移的EC可能涉及复杂的潜在机制，包括肿瘤细胞生物学、MMR系统差异及肿瘤进展阶段不同。早期肿瘤DNA复制次数更少，微卫星偏移可能少于晚期肿瘤。MSH6单独缺失时，MSH3蛋白可部分补偿MSH6的修复功能，MSH2/MSH3异二聚体保留DNA修复能力，阻止DNA损伤显著累积，导致非MSI-H表型。此外，检测样本中肿瘤细胞比例低于30%时，更易出现微卫星微小偏移。采用双核苷酸标志物（D2S123、D17S250、D5S346）的PCR-CE比单核苷酸标志物（BAT-25、BAT-26、MONO-27）更易产生微小偏移。肿瘤细胞比例低时，可采用激光显微切割提高分析准确性。
MMR-IHC与PCR-CE MSI检测确实存在结果不一致，CRC文献报道不一致率为1%-3%，EC文献为3%-7%。MSI分析在CRC中比EC更可靠，因CRC以微卫星显著偏移为主。且MSI峰偏移与特定MMR基因相关，遗传性MSH6缺陷型CRC的MSI峰长度短于其他dMMR CRC。既往研究显示MMR-IHC染色与MSI分析一致性达98.8%，但EC中结果不一致病例以MSH6缺陷为主。重要的是，非MSI-H表型伴MSH6缺失是最常见的不一致类型。携带MSH6胚系突变的肿瘤与其他MMR基因相关肿瘤相比，更易出现MSI和/或IHC表型不一致，主要因MSH6与MSH3功能部分冗余。Wang等研究发现，MSH6胚系致病性变异携带者更易在高龄患EC，且仅MSH6蛋白缺失时，常出现伴微卫星微小偏移的非MSI-H表型。这种非典型MSI模式常被忽视，增加林奇综合征误诊风险。本研究中，结果不一致病例里MSH6单独缺失占68.2%（15/22例），平均绝对偏移为1-2个核苷酸重复（微小偏移）。13例患者成功完成MMR基因胚系突变检测，11例存在MSH6基因胚系突变，3例突变位点相同（MSH6，p.F1088Lfs*）。截短突变可引入提前终止密码子，形成C端截短蛋白，该结构域完全或部分缺失导致ATP酶活性丧失，进而损害DNA结合与错配修复功能。即便如此，PCR-MSI检测方法仍无法真实识别MSH6胚系突变的MSI模式，尤其采用2B/3D panel时。NCI推荐的5个位点可能并非PCR-MSI检测最敏感的扩增子。近期研究提倡Pentaplex panel或Promega panel可提高EC中PCR-MSI检测灵敏度。目前，EC的MSI模式评估更具挑战，因微卫星偏移更细微。因此，Bethesda（2B/3D panel）与Promega（单核苷酸panel）检测结果需经专业培训的分子遗传医师判读，以克服微卫星重复序列微小偏移带来的解读难题。
综上，这些发现表明MMR-IHC与基于PCR的MSI技术并非如既往认为的等效，即便一致性较高，也不足以满足常规临床诊断需求。导致结果差异的因素包括组织缺血缺氧时间、固定不充分等技术与分析前变量。值得注意的是，现有研究强调，与其他MMR基因相关肿瘤相比，MSH6变异携带者的肿瘤更易出现MSI和/或MMR表型不一致。病理医师与临床医师应知晓MSH6胚系变异携带者常表现为微小偏移模式，且结果不一致病例（MSH6单独缺失无MSI-H）是林奇综合征基因诊断的关键环节。此外，MLH1启动子高甲基化或MMR基因体细胞突变可能导致MSS/MSI-L伴MMR缺陷表型，需引起关注。有趣的是，本研究对MSI和/或IHC表型不一致的MLH1缺陷病例行MLH1启动子甲基化检测，3例成功检测出甲基化。相反，PMS2单独缺失在CRC中被视为罕见表型，西方人群中约占MSI阳性肿瘤的4%，中国南方为7.9%。进一步探究该高比例PMS2单独缺失的临床特征与潜在原因具有重要价值。重要的是，PMS2单独缺失主要与微卫星大偏移相关，80%以上不稳定位点偏移超过3个核苷酸，涵盖单核苷酸与双核苷酸重复序列。但该微卫星偏移模式能否作为PMS2单独缺失或PMS2相关林奇综合征的可靠标志物，仍需进一步研究。EC患者行PCR毛细管电泳时，微卫星微小偏移易被忽视或误判为假阴性微卫星稳定结果，MMR-IHC与PCR-MSI联合检测策略可有效解决该问题。此外，MSI-H型EC中，微小偏移与大偏移模式的临床病理特征无显著差异，但偏移模式可反映dMMR亚型特异性，如区分MSH6与PMS2缺陷。未来研究需借助多组学数据进一步探索微卫星偏移模式与肿瘤微环境、治疗疗效的相关性，尤其微卫星微小偏移肿瘤患者的临床病理特征，包括其免疫微环境是否与大偏移肿瘤相似，以及免疫治疗与预后差异。此外，为充分发挥临床价值，需开发自动化工具从PCR片段长度数据计算MSI峰偏移长度，消除人工计数的主观影响。
dMMR ECs中，MSH6单独缺失病例微卫星微小偏移发生率更高，与PMS2单独缺失相关的微卫星大偏移特征不同；且dMMR ECs中MSH6单独缺失发生率更高。诊断层面，基于PCR的MSI检测对MSH6单独缺失病例灵敏度降低，微卫星微小偏移是EC微卫星不稳定性评估的潜在诊断陷阱，也是MMR-IHC与MSI-PCR结果不一致的主要原因。因此，判读时需考虑微卫星微小偏移，MMR-IHC与MSI-PCR互补联合检测是识别MMR缺陷肿瘤最敏感、特异的方法。
参考文献：
Wang C, Feng M, Kou Y, Kuang W, Wang W, Liang D. Evaluation of microsatellite instability patterns in mismatch repair deficiency: a retrospective analysis of 285 endometrial cancers. Front Immunol. 2025;16:1628979. Published 2025 Sep 17. doi:10.3389/fimmu.2025.1628979
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